MedsLib.Ru

В общем нужен ген - репортер, который может сообщать ученым о своей работе в растениях. Решить эту задачу сумели почти одновременно, но по - разному профессор Д. Хелински и его коллеги из Калифорнийского университета в США и группа ученых из Сегедского научного центра в Венгрии и Кельнского института растениеводства в ФРГ, работающих под руководством Аладара Шалаи и Дж. Шелла. Обе группы исследователей попытались использовать в качестве репортеров такие гены, которые дают возможность растениям светиться в темноте. У кого могут быть взяты подобные гены? Правильно, у всем знакомого светлячка. А еще у бактерий из рода вибрионов, живущих в море. Такие бактерии обитают на теле некоторых глубоководных рыб, благодаря чему они светятся.

Способность организмов к свечению (биолюминесценции) определяется тем, что у них есть органические соединения, называемые люцифери - нами, от латинского lucifer — светоносный. При переходе этих соединений из «возбужденной», окисленной формы в основное, неокисленное состояние происходит испускание света. Окисление люциферинов обеспечивается работой ферментов, называемых люциферазами. Хелински и его сотрудники соединили ген люциферазы с промотором одного из вирусов растений. Рекомбинантный i си ввели в составе промежуточного вектора в агро - бактерию, заразили ею клетки табака, а затем из них вырастили целое растение.

Для целей генной инженерии оказалось важным, что промоторы даже совершенно различных видов растений могут быть близки между собой. Это сходство позволило, например, генам однодольных растений, переданным в двудольные, «прижиться» в новых хозяевах. Так, ген зеина — запасного белка кукурузы «заработал» в клетках опухоли подсолнечника, ген пшеницы, кодирующий один из важных белков фотосинтеза — в нормальных табаке и петунии. Примечательно, что в этих растениях «пшеничный ген» сохранил свои характерные черты. Он функционировал только в клетках листьев, то есть органоспецифично, да к тому же не постоянно, а лишь при солнечном освещении. Можно привести и другие сходные примеры: гены запасного белка сои (конглицинина) и фасоли (фазеолина), будучи перенесенными в петунию, табак и подсолнечник, эффективно транскрибировались, но не во всех частях растений, а именно там, где и должно происходить накопление запасных белков в семенах. Ген фазеолина работал в семенах табака столь активно, что списывающаяся с него мРНК составила заметную долю суммарной мРНК семян. В других тканях трансгенных растений табака (листьях, проростках, каллусе) ген фазеолина экспрессировался в тысячу раз хуже.

Вирусный промотор, кроме того, оказался способным обеспечивать экспрессию генов млекопитающих: гена одного из половых гормонов человека, а также крысиного гена, кодирующего устойчивость клеток к сульфаниламидным препаратам.

Промоторы из Т - ДНК и растительных вирусов действительно неплохие, но разве нет у растений собственных, подходящих по многим признакам промоторов, чтобы каждый раз не «брать напрокат» то от бактерий, то от вирусов? Конечно, есть. Да только выделить растительный промотор, получить его в виде изолированного фрагмента ДНК очень непросто.

Как же выявить маленькие промоторные последовательности в громадном геноме растений? На помощь в решении этой задачи пришли рестриктазы и специальные векторы для отбора промоторов. Такие векторы содержат «обезглавленные» гены. В них сохранена кодирующая какой - либо фермент последовательность нуклеотидов, а промотор, без которого ген «молчит», отсутствует. Для того чтобы такой ген «заговорил», он должен быть присоединен к промоторной последовательности. Нарезанные рестриктазами сегменты растительного генома вставляют в участок вектора, примыкающий к «молчащему» гену, а гибридные молекулы трансформируют в растительные клетки.

Посмотрим теперь, как эти условия удается выполнить на самом деле. Про сильные промоторы уже говорилось. Пока больше других генным инженерам растений подошли промоторы генов синтеза опинов из Ti - плазмид, в особенности нопалинового гена, а также пара промоторов, присутствующих в ДНК вируса CaMV. С их помощью различные чужеродные гены эффективно заработали в трансформированных клетках растений. Однако не всегда сильный — значит лучший. Бывают случаи, когда усиленная экспрессия какого - либо введенного гена ведет к нежелательной для клетки сверхпродукции кодируемого этим геном белка — она замедляет рост или даже гибнет.

Нужно, правда, отметить, что уровень экспрессии введенного гена даже под контролем сильного промотора может различаться от растения к растению. Многое зависит от того, в какое место растительного генома встроится новый ген. В генетике это явление известно как «эффект положения». Оно показывает, что экспрессия каждого гена определяется не только силой его промотора, но зависит и от окружающих ген соседних последовательностей нуклеотидов. По некоторым данным, вариабельность в экспрессии введенного гена у разных растений зависит от того, в каком числе копий внедрился новый ген в геном растений.

Вскоре помимо табака и петунии удалось трансформировать томат, подсолнечник, сою, турнепс, морковь и некоторые другие двудольные растения. Продолжались поиски возможностей использовать новые промоторы, способные обеспечить экспрессию химерного гена в растениях даже более эффективно, чем нопалиновый промотор. Примечательным моментом в этой серии работ было также использование генов устойчивости к другим антибиотикам — это помогает ученым отрабатывать методы введения генов в различные растения. Например, клетки сои очень чувствительны к гигромицину В, но устойчивы к канамицину, значит, подбирая подходящие антибиотики, можно ввести в круг объектов генной инженерии все большее число видов растений.

Теперь, когда мы уже кое - что знаем об используемых для трансформации растений селективных маркерах, посмотрим, каким же условиям должен удовлетворять промотор, чтобы обеспечить работу введенных в растения чужеродных генов? Таких условий несколько. Об одном мы уже упоминали ранее — это сила промотора. Сильный промотор обеспечивает активную экспрессию, синтез многих молекул мРНК, а значит, и белка — продукта данного гена. Другое условие — экспериментатор должен иметь возможность по своему желанию регулировать работу подстроенных под промотор генов. Третье условие состоит в том, что промотор должен быть способным обеспечивать работу введенных генов именно в тех органах и тканях, где это будет наиболее целесообразно.

Исследователи решили взять реванш за неудавшуюся ранее попытку протащить в растения и заставить в них работать ген устойчивости к канамицину (кап), просто вставив Тп5 в плазмиду Ti. Теперь тактика была иная: сконструировали химерный ген, объединив регуляторные элементы гена nos со структурной частью гена кап и эту конструкцию ввели в Т - район Ti - плазмиды вместо нормального гена nos. Химерный ген заработал в трансформированных клетках табака и петунии, делая их устойчивыми к канамицину. Этот факт был практически одновременно установлен в лабораториях Дж. Шелла и М. ван Монтегю, М. Д. Чилтон, а также в исследованиях Роберта Фрели и его коллег из американской компании «Монсанто». Детали этих работ отличались, но во всех случаях в конструкцию химерных генов входили промотор и еще несколько сигнальных элементов гена nos.

Видимое доказательство переноса чужеродного гена — образование трансформированными клетками колоний на среде с канамицином — подкреплялось и биохимическими данными. Анализ ДНК трансформантов прямо выявил присутствие в ней химерного гена. Было также показано, что с этого гена в растениях синтезируется мРНК. В экстрактах трансформированных клеток была обнаружена активность НФТ — белка, кодируемого введенным геном.

Этот в сущности бактериальный ген оказался на редкость подходящим для генной инженерии растений. Он отлично приспособлен для работы в растениях. В бактериях ген nos «молчит»: в них не образуется нопалинсинтаза, а значит, соответственно, и нопалин. Как мы уже знаем, бактерии используют опины в готовом виде, получая их с «фабрик» корончатых галлов; чтобы клетки галлов могли производить опин, бактерия передает им нужный для этого ген в составе Т - района своей Ti - плазмиды. Надо сказать, что это производство очень эффективно, поскольку природа снабдила ген nos очень сильным, то есть активным, распознаваемым в клетках растений промотором, с которого может списаться много молекул мРНК, а с них уже насинтезироваться много молекул фермента. Наличие сильного растительного промотора и других сигнальных элементов, нужных для работы генов в растениях, стало главной причиной, почему ученые обратили самое пристальное внимание именно на ген nos и решили попробовать его промотор присоединить к какому-нибудь чужеродному для растений гену, чтобы заставить его работать в новом хозяине.

Первой об успешности такого подхода сообщала в январе 1983 года группа Шелла — ван Монтегю. Они присоединяли промотор гена nos к структурной части гена октопинсинтазы (ocs) из плазмиды Ti октопинового типа либо гена устойчивости к хлорамфениколу из транспозона Тп9. Химерные гены в составе Т - ДНК были введены в клетки растений. В трансформированных клетках, получивших первую либо вторую гибридную конструкцию, синтезировались соответственно октопинсинтаза либо фермент, инактивирующий хлорамфеникол. Следовательно, в обоих случаях но - палиновый промотор работал.

Вначале было решено посмотреть, нельзя ли под контролем эукариотического промотора добиться экспрессии (нормальной работы) в растениях различных, эукариотических же, генов. Для этого к одному из промоторов вируса SV40, вызывающего опухоли у обезьян, стали подшивать разные «чужеродные» для растений гены, взятые, например, у дрожжей или животных. Все эти попытки оказались неудачными; в растениях не обнаруживали ни белков — продуктов этих генов, ни соответствующих им молекул мРНК. Однако неудачный результат выявил еще одну важную истину — в растительных и животных клетках, несмотря на то, что и те и другие эукариоты, сигналы, позволяющие генетической информации передаваться с ДНК на РНК, отличаются. Следовательно, для того, чтобы чужеродный ген полноценно заработал в растительной клетке, его нужно снабдить распознаваемыми ею промоторами и другими сигнальными элементами. Но к тому времени, когда это стало ясно, 5 — 6 лет назад, имелись лишь отрывочные сведения о том, как устроены растительные гены и как они регулируются.